Получение двухцепочечных гибридов из смесей одноцепочечных ДНК и РНК

Возник вопрос: нельзя ли получить двухцепочечные гибриды из смесей одноцепочечных ДНК и РНК? Подобные гибриды послужили бы доказательством полной или почти полной комплементарности последовательностей их оснований. А. Рич и Доти установили к этому времени, что молекулы синтетической РНК, состоящие только из аденина, образуют гибриды с молекулами синтетической ДНК, содержащими в качестве единственного основания тимин.

Имея в виду все эти работы, мы задались целью выяснить, будет ли РНК, специфичная для фага Т2, давать гибриды с его ДНК. Прежде всего необходимо было преодолеть некоторые технические трудности. Мы уже разработали методы получения Т2-специфичной РНК в достаточно очищенном виде. Но надо было так поставить эксперимент, чтобы при возникновении гибридной структуры суметь уловить и идентифицировать ее.

Все предыдущие работы по восстановлению двухцепочечной структуры ДНК проводились с ощутимыми количествами вещества, так что при центрифугировании образовывались слои, которые можно было легко обнаружить оптическими методами. Количества же гибридных молекул в нашем опыте были ничтожны и надежда уловить их оптическими методами также была очень мала.

Наконец был разработан удачный метод. Прежде всего мы воспользовались тем, что по своей плотности РНК несколько отличается от ДНК; их гибриды, следовательно, должны иметь какую-то промежуточную плотность. Молекулы же с различной плотностью можно разделить путем центрифугирования в градиенте плотности. Этот метод разработан М. Меселсоном, Ф. Сталем и Д. Виноградом; они помещали анализируемый образец в раствор хлористого цезия, после чего смесь центрифугировали около трех дней со скоростью 30 000 (и даже больше) оборотов в минуту. В результате такого длительного центрифугирования создается градиент плотности; на дне пробирки плотность будет наибольшей, постепенно уменьшаясь к поверхности. Исследуемые компоненты перемещаются в слои солевого раствора, точно соответствующие им по плотности.

Вместо аналитической ультрацентрифуги мы выбрали центрифугу с подвесным бакет-ротором, которая позволяет выделять и анализировать различные фракции. Для этого достаточно проколоть дно полиэтиленовой центрифужной пробирки и собирать фракции по каплям для дальнейшего анализа (смотрите рисунок ниже).

Центрифугирование в градиенте плотности

Центрифугирование в градиенте плотности позволяет установить, произошла ли гибридизация между РНК и ДНК. Исследуемый препарат добавляют к раствору хлористого цезия (1 и 2). В результате центрифугирования (3) возникает градиент плотности солевого раствора. РНК (черные точки), ДНК (белые кружки) и гибриды РНК - ДНК перемещаются в те слои раствора которые соответствуют им по плотности. Фракции затем собирают (4) и анализируют.

«Молекулы и клетки», под ред. Г.М.Франка

• Устранение загрязнения меченой информационной РНК
• Гипотеза о составе молекулы 23S-PHK из двух молекул 16S-PHK
• Способы передачи информации в клетке
• Синтез белковых молекул в живой клетке
• Результат эксперимента изучения РНК с помощью радиоактивных изотопов
• Повышение чувствительности и точности метода обнаружения гибрида
• РНК копия вирусной ДНК
• Свойства РНК бактерий, синтезированная после пересева клеток на бедную среду
• Рибосомная РНК
• Последовательность оснований транспортных РНК
• Разделение цепей обычной ДНК