Главная / Молекулы и клетки / Гибридные нуклеиновые кислоты / Повышение чувствительности и точности метода обнаружения гибрида

Повышение чувствительности и точности метода обнаружения гибрида

30.05.2010г.

Для того чтобы повысить чувствительность и точность метода обнаружения гибрида, мы метили РНК и ДНК разными радиоактивными изотопами. Так, мы пометили Т2-специфичную РНК радиоактивным фосфором (Р32), а ДНК фага Т2 — радиоактивным водородом (Н3).

β-Частицы, испускаемые этими двумя изотопами, различаются по своим энергиям; поэтому Р32 и Н3 можно определять в присутствии друг друга. Если оказывается, что слой помечен одновременно Р32 (РНК) и Н3 (ДНК), то это значит, что он содержит гибридную фракцию (смотрите рисунок ниже).

Опыт с гибридизацией

Опыт с гибридизацией

Опыт с гибридизацией показывает, что РНК, синтезированная после заражения клетки фагом Т2, генетически близка фаговой ДНК. РНК метят радиоактивным фосфором, а ДНК фага Т2 — радиоактивным водородом (тритием). Препарат центрифугируют в градиенте плотности (смотрите рисунок ниже) и определяют радиоактивность в различных фракциях. Хотя некоторое количество РНК оседает на дно пробирки, значительная ее часть образует гибриды с более легкой фракцией ДНК и поэтому обнаруживается во фракции № 4 (каждая фракция имеет объем 1 миллилитр). I — РНК; II — ДНК.

Смотрите рисунок - Центрифугирование в градиенте плотности

Впоследствии мы заметили, что этот слой почти совпадает со слоем негибридной ДНК. Поэтому мы перестали метить ДНК, а ее присутствие устанавливали просто по сильному поглощению в ультрафиолете при длине волны 260 миллимикрон.

С помощью всех этих методов нам вскоре удалось установить, что Т2-специфичная РНК и ДНК фага Т2 действительно образуют гибриды, близкие по общему составу оснований к ДНК фага Т2. Оставалось доказать, что гибриды возникают только между генетически родственными РНК и ДНК. Мы инкубировали Т2-специфичную РНК с ДНК, полученной из самых различных бактерий и вирусов. Ни в одном случае не удалось обнаружить образование гибридов — даже тогда, когда чужеродные дезоксирибонуклеиновые кислоты, по всей видимости, не отличались по общему составу оснований от ДНК фага Т2.

Результаты наших опытов позволяют заключить, что по последовательности оснований Т2-специфичная РНК комплементарна по крайней мере одной из двух цепей ДНК этого фага. Итак, сходство состава оснований, впервые отмеченное Волкином и Астраханом, является отражением более глубокой связи между этими нуклеиновыми кислотами.

Наши опыты проливают также некоторый свет на процессы, протекающие в бактериальной клетке после ее заражения вирусом. Если обеспечить заражение всех взятых клеток, то мы обнаружим, что вновь синтезированная РНК не дает гибридов с ДНК бактерии-хозяина. Из этого следует, что после заражения вирулентным фагом почти сразу же прекращается синтез информационной РНК хозяина.


«Молекулы и клетки», под ред. Г.М.Франка





Читайте далее: