Радиоавтография для определения скорости, с которой клетки синтезируют рибонуклеиновую кислоту
Мы воспользовались радиоавтографией (смотрите рисунок ниже) для определения скорости, с которой наши клетки синтезируют рибонуклеиновую кислоту (РНК), дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и белки.
Схема изотопного метода
Прежде всего (1) в среду, содержащую плазмабласт, добавляют тритий, радиоактивный изотоп водорода (капля этой среды наносится на нижнюю поверхность покровного стекла). Меченый водород включается в тимидин, который затем в виде тимина входит в состав клеточной ДНК. Клетку переносят микропипеткой на чистое сухое стекло (2) и фиксируют метанолом (3). Затем микрокаплю с клеткой покрывают фотоэмульсией (4) и выдерживают некоторое время в темноте (5); при этом за счет радиоактивного распада трития происходит засвечивание эмульсии, так что становятся видны те участки, которые содержат радиоактивное вещество, иначе говоря, те участки, в которых протекал биосинтез ДНК (6).
В качестве радиоактивного изотопа мы обычно применяли тритий (Н3). Для изучения синтеза ДНК, например, метку вводят в тимидин (предшественник, содержащий тимин, один из компонентов ДНК), а для исследования белкового синтеза — в аминокислоту. Затем меченое вещество вносят в микрокаплю с клеткой. Через определенный промежуток времени клетку отмывают, сушат на стеклянной пластинке, фиксируют, покрывают слоем фотоэмульсии (все операции производятся, конечно, с помощью микроманипулятора) и помещают в темное место.
Спустя несколько дней или недель пластинку проявляют и фиксируют обычным путем. На эмульсии появляется потемнение, вызванное радиоактивным излучением клетки. Радиоактивность зависит от количества меченого вещества, усвоенного клеткой из культуральной среды за время, прошедшее до момента фиксации. Подсчитывая число почерневших зерен на фото-эмульсии, можно определить скорость, с которой клетка синтезирует данное соединение (РНК, ДНК или белок).
Количество ДНК отражает скорость клеточного деления, так как содержание генетического материала в клетке удваивается непосредственно перед ее делением. Исследуя с помощью радиоавтографии синтез ДНК, мы установили, что молодые плазмабласты делятся примерно каждые 10 часов (смотрите рисунок ниже); это почти соответствует обычной скорости деления клеток млекопитающих.
Развитие плазмацитов
На этой схеме представлено развитие плазмацитов (пять стадий). Слева указаны соответствующие поколения. Примерно через 10 часов после встречи с антигеном плазмабласт начинает делиться. С каждым днем интервалы между делениями увеличиваются; лишь на пятые сутки зрелые плазмациты, относящиеся к девятому поколению, начинают синтезировать большие количества антител (крупные точки). В процессе созревания плазмацита ядро съеживается; объем же цитоплазмы по мере того, как клетка переключается на образование антитела, напротив, увеличивается. Ядро уплотняется, так что его ядрышки (два более темных пятна в клетке на верхнем рисунке) перестают быть видимыми.
Однако, когда потомство этих клеток достигает стадии зрелых плазмацитов, деление, по-видимому, прекращается.
«Молекулы и клетки», под ред. Г.М.Франка
Читайте далее:
