Реакции иммунофлюоресценции (техника постановки реакции)

Из антигена готовят препараты на тонких хорошо обезжиренных предметных стеклах, на обратной стороне которых обозначены кружки диаметром 1 см. Запаянным концом пастеровской пипетки круговыми движениями распределяют антиген в пределах кружка, и высушенный на воздухе мазок фиксируют в течение 5 мин в чистом ацетоне. 

После фиксации стекла помещают во влажную камеру. Инактивированные испытуемые сыворотки крови разводят в 200 раз изотоническим раствором натрия хлорида. Для проведения первой фазы реакции на помещенные во влажную камеру препараты наносят испытуемые сыворотки. 

Для того, чтобы покрыть препарат, достаточно 1 капли сыворотки. После этого влажную камеру закрывают и помещают в термостат при температуре 35 °С на 30 мин. По истечении этого времени препараты вынимают из влажной камеры, промывают в течение 10 мин в двух порциях изотонического раствора натрия хлорида и помещают в штатив для высушивания. 

После высушивания препараты вновь помещают во влажную камеру и наносят по капле разведенной по титру флюоресцирующей сыворотки против глобулинов человека. Вторую фазу реакции проводят при комнатной температуре, после чего препараты 10 мин промывают в изотоническом растворе натрия хлорида, высушивают и монтируют для люминесцентной микроскопии. 

Монтирование препаратов заключается в том, что на них стеклянной палочкой наносят маленькие капли забуференного глицерина (1 часть фосфатного буфера при рН 7,4 и 9 частей глицерина), накрывают их тонкими, хорошо обезжиренными предметными стеклами, на которые стеклянной палочкой наносят по капле нелюминесцирующее иммерсионное масло (диметилфталат). Исследование препаратов производят в люминесцентном микроскопе или в люминесцентном устройстве ОИ-17. 

Степень свечения трепонем, зависящая от количества антител в сыворотке крови, обозначается плюсами. Свечение считается положительным, если его оценивают как 4+, 3+ и 2+. Реакция иммунофлюоресценции-абсорбции с бледной трепонемой (FTA-ABS).

Используемый для реакции антиген представляет собой взвесь бледных трепонем из пораженных сифилисом яичек кролика, фиксированную ацетоном на предметном стекле. Можно также использовать лиофилизированные бледные трепонемы после их восстановления в изотоническом растворе натрия хлорида. 

Инактивированную сыворотку инкубируют с сорбентом (трепонемы Рейтера) для абсорбирования неспецифических групповых антител. Затем сыворотку помещают пипеткой на антиген, находящийся на предметном стекле. Специфические антитела (глобулины) связываются бледными трепонемами. 

После промывания к трепонемам на предметном стекле добавляют комплекс античеловеческого глобулина с флюоресцентным красителем (флюоресцеин — изотиоцианат). Этот комплекс связывается с человеческим глобулином на оболочке клеток бледных трепонем и может быть идентифицирован методом флюоресцентной микроскопии. По прошествии не менее 2 ч по степени флюоресценции сыворотку можно классифицировать как нереактоспособную, пограничную или реактоспособную.

Реакция, обозначаемая двумя плюсами или больше, свидетельствует об инфекции. Появления реактоспособности можно ожидать примерно в начале 3-й недели после заражения, а у нелеченных больных она обнаруживается постоянно. 

Сыворотка остается реактоспособной и через несколько лет после успешного лечения раннего сифилиса, а у больных, получивших адекватное лечение при позднем сифилисе — на протяжении десятилетий. Главными достоинствами реакции FTA-ABS являются довольно высокая специфичность и чувствительность, а также быстро наступающая реактоспособность. 

Положительная FTA-ABS может иметь решающее значение для диагностики сомнительных случаев, особенно при положительных реакциях VDRL или автоматизированной реакции микрогемагглютинации (АМНА-ТР), используемых для скрининга. Реакция 19S IgM-FTA-ABS. 

При идентификации антител IgM к бледным трепонемам реакцией FTA-ABS с использованием конъюгата анти-IgM в качестве реагента выявлялись ложноположительные и ложно отрицательные результаты. Реакция 19S IgM-FTA-ABS в этом отношении является наиболее точным, специфичным методом. 

В целях отделения крупных молекул 19S IgM от более мелких молекул 7S IgM используется методика ультрацентрифугирования, адсорбирования на белке А и гель-фильтрация с применением ультрагеля АсА 34 с трисбуфером при рН 8,0 на колонке К 26/100 при объеме геля 300 мл, скорости потока 27 мл/ч и температуре 24 °С. В этой системе первый пик элюата содержит фракцию 19S IgM. 

В процессе фильтрования отделяются непрочные иммунные комплексы. Использование фракции 19S IgM в реакции FTA-ABS обеспечивает высокую специфичность, устраняя возможность неспецифических, ошибочных результатов.

«Болезни передающиеся при половых контактах»,
Ю.К.Скрипкин

• Ускоренный метод серодиагностики сифилиса (приготовление эмульсии кардиолипинового антигена)
• Реакция с липоидиым антигеном VDRL
• Реакции иммунофлюоресценции
• Реакции иммунофлюоресценции (антиген)
• Реакция иммобилизации бледных трепонем
• Реакция иммобилизации бледных трепонем (антиген)
• Реакция иммобилизации бледных трепонем (среда сохранения трепонем)
• Реакция иммобилизации бледных трепонем (техника постановки реакции)
• Ошибки в диагностике сифилиса
• Реакция иммунного прилипания бледных трепонем (РИП)
• Ошибки в диагностике сифилиса (частные случаи)
• Реакция иммунного прилипания бледных трепонем (техника постановки)
• Ошибки в диагностике сифилиса (ошибки терапевтов)
• Реакция гемагглютинации с бледными трепонемами (ТРПГА)
• Ошибки в диагностике сифилиса (симптоматика ранних сифилитических поражений)
• Клиническая оценка серологических реакций
• Серологическая диагностика сифилиса
• Клиническая оценка серологических реакций (постановка диагноза)