Главная / Болезни передающиеся при половых контактах / Сифилис / Диагностика сифилиса / Реакция иммобилизации бледных трепонем (техника постановки реакции)

Реакция иммобилизации бледных трепонем (техника постановки реакции)

06.05.2010г.

Пронумерованные пробирки с сыворотками расставляют в штатитве. В журнале нечетными номерами отмечают все смесители, в которые добавлялся активный комплемент (опыт), и четными номерами — куда добавлялся инактивированный комплемент (контроль).

Комплемент добавляют не для каждой сыворотки отдельно, а готовят «коктейль», т. е. предварительно соединяют комплемент с антигеном в нужных соотношениях для всех сывороток. Взвесь трепонем в питательной среде из расчета по 0,3 мл на каждую сыворотку делят на 2 части и добавляют в один флакон активный комплемент, а в другой — инактивированный.

В стерильный смеситель для лейкоцитов набирают сыворотку до метки 1. Конец смесителя стерильной ваткой вытирают от сыворотки, оставшейся на стенках. Вытирать концы смесителя необходимо, так как при попадании положительной сыворотки в антиген в последующих сыворотках могут быть получены неверные результаты.

Во избежание загрязнения при больших постановках разливают антиген параллельно в два флакона. После этого до метки 2 набирают взвесь трепонем с активным комплементом. В другой смеситель набирают взвесь трепонем с инактивированный комплементом.

Оба конца каждого смесителя закрывают резиновым кольцом, как для транспортировки крови, взятой для клинического исследования, и встряхивают для смешивания. При отсутствии таких колец их можно сделать самому, разрезав полую резину с диаметром до 1 см вдоль и соединив концы. Кольца до опыта и каждый раз после опыта следует кипятить. Во избежание возможного влияния некоторых сортов резины места соприкосновения резины со смесителем следует смазывать стерильным вазелиновым маслом.

Можно не закрывать концы смесителя резиновыми кольцами, а заливать их парафином с температурой плавления выше 50 °С (парафин с более низкой температурой плавления непригоден, так как при помещении смесителей в термостат парафин может стечь и герметичность системы будет нарушена), однако это менее удобно. Благодаря тому, что оба конца смесителя закрыты, прекращается доступ воздуха, взвесь трепонем находится в относительно анаэробных условиях.

Для контроля набираются в те же смесители все взвеси с активным и инактивированный комплементом, а также одна взвесь без комплемента. Ставят также реакцию иммобилизации с сыворотками, заведомо отрицательными и заведомо положительными, оставшимися от прошлой постановки.

Заполненные и закрытые смесители помещают в специальный штатив или коробку с вырезами. Чтобы не перепутать, на каждый смеситель надевают нумерованные кольца из картона. Смесители помещают в термостат при температуре 35 °С на 18 — 20 ч.

Для регистрации опыта через 18 ч смесители вынимают из термостата попарно
— опыт и контроль. Подсчет подвижных и неподвижных трепонем. По количеству смесителей в штативе расставляют и нумеруют маленькие пробирки (12*60 мм).

Содержимое смесителя выливают в соответствующую нумерованную пробирку, перемешивают тем же смесителем с надетой на него пипеткой и наносят каплю взвеси с активным комплементом на левую сторону предметного стекла, а на правую сторону — с инактивированный комплементом той же сыворотки, посредине стекла ставят номер сыворотки. Капли накрывают покровными стеклами 20х20 мм.

Капли должны быть небольшими, иначе трепонемы «плывут» с током жидкости, и тогда суждение об их подвижности и подсчет затруднительны. Учет результатов реакции начинают с инактивированного комплемента. Подсчитывают 25 — 30 трепонем и отмечают, какое количество среди них подвижных и какое — неподвижных.

Если в контроле содержится меньше 17 подвижных трепонем из 25 сосчитанных, то такой опыт непригоден и его следует повторить. В пробирках с инактивированный комплементом отсутствие подвижности трепонем объясняется не иммобилизацией, а токсичностью сыворотки или недостаточно высоким качеством среды сохранения (загрязнение бактериями, примесь медикаментов и т. д.).

При определении подвижности трепонем следует учесть, что движения трепонем различны. Они могут обладать весьма активной подвижностью, особенно отчетливы сгибательные движения, а иногда отмечаются только винтовые движения. Иногда трепонема лежит как бы неподвижно, но если присмотреться, то видно, что через некоторое время она начинает активна двигаться.

Следует также уметь отличать активные движения трепонемы от движения с током жидкости. В пробирках, в которые вылили содержимое смесителей, в дальнейшем определяют остаточный комплемент (во всех пробирках опыта и контроля). Пробирки с инактивированный комплементом служат как бы контролем для сравнения происшедшего гемолиза.

Расчет специфической иммобилизации производят по следующей формуле:

Число подвижных трепонем в контроле — число подвижных трепонем в опыте/ Число подвижных трепонем в котроле *100.

Реакция иммобилизации считается положительной, когда процент иммобилизации выше 51, от 31 до 50% — слабоположительной, сомнительной — от 21 до 30% и отрицательной — ниже 20%.

Опыт с сомнительными, а иногда и слабоположительными результатами следует повторить, при этом можно получить или положительный, или отрицательный результат. Неудовлетворительным считается результат, если имеется большое бактериальное загрязнение или отмечается токсичность сыворотки. Такие исследования следует повторить с новой порцией сыворотки.

Целесообразно также подвергать повторному исследованию все сыворотки, давшие полное расхождение со стандартными серологическими реакциями. Эти сыворотки заслуживают особого внимания, так как в таких случаях результаты РИБТ могут дать опору для суждения о наличии или отсутствии сифилиса.

При постановке опыта обращают внимание на соблюдение стерильности и чистоты посуды. Она должна быть свободна от примеси веществ, могущих оказать вредное влияние на жизнеспособность трепонем. Смесители и всю посуду моют сначала холодной водой, затем горячей, споласкивают дистиллированной водой, не применяя никаких дезинфицирующих средств.

Смесители стерилизуют в автоклаве, подсушивают в сушильном шкафу. Описанная методика РИБТ достаточно проста и дает возможность ставить реакцию иммобилизации всюду, где имеются квалифицированный персонал и возможность содержать кроликов. Этот метод можно использовать также с другими питательными средами.

«Болезни передающиеся при половых контактах»,
Ю.К.Скрипкин



Читайте далее: